76-03-9/三氯乙酸沉淀蛋白的原理及方法

三氯乙酸又名三氯醋酸，易潮解 ，溶于水、乙醇、乙醚 ，主要用于有機合成和制醫藥、化學試劑、殺蟲劑。實驗中常常需要用三氯乙酸來沉淀蛋白，那么它的原理是什么？如何操作的呢？

三氯乙酸沉淀蛋白原理

① 在酸性條件下與蛋白質形成不溶性鹽；

② 作為蛋白質變性劑使蛋白質構象發生改變，暴露出較多的疏水性基團, 使之聚集沉淀；

③ 隨著蛋白質分子量的增大，其結構復雜性與致密性越大，TCA 可能滲入分子內部而使之較難被完全除去，在電泳前樣品加熱處理時可能使蛋白質結構發生酸水解而形成碎片，而且隨時間的延長這一作用愈加明顯；

④ 電泳圖譜顯示，BSA、HSA 單體譜帶有較明顯的展寬現象，這可能是由于TCA 的結合，使SDS 與蛋白質的結合量產生偏差，從而造成蛋白質所帶電荷的不均一性，造成遷移率的不一致。

三氯乙酸沉淀蛋白方法

1)加1/4體積的 TCA+DOC于蛋白質組分（置1.5-ml聚丙烯微量離心管中），至TCA的終濃度為20%(w/v)。震蕩混合。

2)冰上解育20~30 min。

3)微型離心機，室溫離心15 min。沉淀物如可見，為粘稠的帶黃褐色的膠狀物。用一精細的巴氏吸管吸出上清。努力除去盡可能多的上清。如取100ul樣品進行沉淀，沉淀物將是可見的。

4)加3倍體積（原樣品體積的丙酮（室溫)。樣品在室溫下靜置約10 min, 使TCA+DOC溶于丙酮。

5)室溫離心15 min。其時，沉淀物的大小和物理特性類似于一點灰塵。約10ug或更多一點的蛋白質即可看見。有時，會得到白色的鹽類（如KCl等）沉淀物。用極精細的巴氏吸管移去上清。沉淀物置冰上干燥10 min(敞開1.5-ml離心管的蓋)。干燥的沉淀物可長時間（>1 個月）地保存于-20℃。

6) 用含 2-巰基乙醇的樣品緩沖液（lx)(對于標準的小型平板凝膠裝置，用 6ul) 溶解沉淀物。如仍有少量的TCA 殘留物，溴酚藍將轉呈黃色。這無關緊要，因為電泳時有足夠的緩沖能力來中和痕量 TCA。如沉淀物中有殘留的 KCl, 將樣品緩沖液加于沉淀的蛋白質時，將會形成絮狀的白色沉淀（十二烷基硫酸鉀）。如十二烷基硫酸鉀發生沉淀，就很難將樣品加于 SDS 凝膠，但樣品一旦加到凝膠上，電泳將會很好地進行。

7) 若需分子量標準參照物，則可用不含 2-巰基乙醇的 lxSDS 樣品緩沖液將蛋白質分子量（MW) 標準配制成每毫升含 0.5 mg 總蛋白的儲液。分成小等分試樣 (50ul) 儲存于-20℃。對于銀染，可取 2ul 分子量標準+4ul 含 2-巰基乙醇的樣品緩沖液，至終體積為6ul。

來源：元素商城