25641-18-3 / 偶氮胭脂紅G的應用

背景及概述

偶氮胭脂紅 G 是一種酸性三苯甲烷類染料。

應用^[1]

一、偶氮胭脂紅G分光光度法測定蛋白質

在酸性介質中，偶氮胭脂紅 G與蛋白質在室溫下能迅速結合并導致體系的吸收光譜發生明顯改變。王琳琳等基于此結合反應建立了一個測定蛋白質的光度分析新法。

1、實驗方法： 在 10 m L 比色管中， 依次加入適量的蛋白質標準溶液( 在條件實驗中均加入 BSA作為標準蛋白)或樣品溶液，2 . 0 ×10^-4 mol/ L的偶氮胭脂紅 G 溶液 1.0 mL 和 1.0 mol/L 的 H₂SO₄溶液2.0 mL，用水稀釋至刻度并搖勻，在室溫下以相應的試劑空白為參比， 用 1 cm 比色皿，在波長570 nm 處即時測定吸光度.

2 結果與討論

2.1吸收光譜 在酸性介質中，偶氮胭脂紅 G 溶液為粉紅色，加入蛋白質后 ，溶液由粉紅色變為紫紅色，其吸收曲線如圖 1 所示?？梢姡谂嫉僦tG 的試劑空白中加入牛血清蛋白質后，導致試劑空白的吸收峰位由 520 nm 紅移至 570 nm，表明偶氮胭脂紅G 與 BSA 之間生成了復合物 . 實驗選擇570 nm 作為測定波長.

2.2反應酸度的選擇 實驗發現， 蛋白質與偶氮胭脂紅 G 之間的結合反應只有在強酸性介質中才能發生，結合體系的最大吸光度在 pH <1. 5 時依然沒有出現，于是實驗采用 1.0 mol/ L的 H₂SO₄ 直接控制體系的 pH，并試驗了1.0 mol/L H₂SO₄ 的加入量對結合體系吸光度的影響. 結果表明，1.0mol/L H₂SO₄ 的加入量過高或過低都將導致結合體系吸光度的下降，而當 H₂SO₄ 的加入量為 2.0mL 時，結合體系的吸光度達到最大值。因此，實驗中加入 2.0 mL 1.0 mol/L 的 H₂SO₄ 控制體系的酸度.

2.3偶氮胭脂紅 G 用量的選擇 在 0.5～3.5 mL范圍內，優化了2.0×10^-4 mol/L 偶氮胭脂紅G 的用量。結果表明，隨偶氮胭脂紅 G 用量的增加，體系吸光度逐漸增大，但當偶氮胭脂紅 G 用量的達到1.25 mL 以上時，體系放置 20 min 以上即有沉淀出現，為使體系的靈敏度最大，同時又具有一定的穩定性，實驗選擇偶氮胭脂紅 G 溶液的用量為1.0 m L .

2.4反應溫度、時間、穩定性及加入順序 在選定的酸度和染料用量條件下， BSA 與偶氮胭脂紅 G之間的結合反應可在室溫下迅速發生，加入試劑混合均勻后，體系的吸光度就達到了最大值并與試劑的加入順序和放置時間(至少在 3 h 內) 基本無關，說明該體系具有快速、穩定、簡單的特點.

2.5工作曲線與靈敏度 在上述選定的測定條件下，分別研究了體系在 570 nm 的吸光度與各蛋白質濃度之間的關系，得到了牛血清蛋白(BSA)、人血清蛋白(HSA) 和免疫球蛋白(IgG) 的工作曲線及其線性回歸方程 ，并由線性回歸方程的斜率計算了摩爾吸光系數及 Sandell 靈敏度， 結果列于表 1中。由表 1 的數據可見，本法對于這 3 種蛋白質的測定具有較寬的線性范圍和較好的靈敏度，且對人血清蛋白和免疫球蛋白具有非常相近的響應，因此可用于血清樣品中總蛋白的測定 .

2.6 共存物的影響 對多種氨基酸、金屬離子及蛋白酶等對 5.0 μg/m L BSA 測定的影響進行了試驗，結果見表2。可見，當允許相對誤差在±5%以內時，大部分共存物的允許存在量較高，說明方法具有較好的選擇性。

2.7 樣品分析 將方法直接用于稀釋1000 倍后的人血清樣品( 云南大學校醫院提供) 中總蛋白含量的測定，且在 1.0 mL 血清樣品中分別加入人血清標準蛋白質進行加標回收測定，其結果見表 3?？梢姡帽痉椒y得的結果與 CBBG -250 法測得結果基本一致.

主要參考資料

[1]王琳琳，王俊芳，張媛，丁中濤，曹秋娥.偶氮胭脂紅G分光光度法測定蛋白質的研究[J].云南大學學報(自然科學版)，2008(01):83-86.